kit
Contents Specifications
Validated sgRNA plasmid 2ug, 200ng/ul
Blank vector 2ug, 200ng/ul
Cas9 vector 2ug, 200ng/ul
Donor (homozygous arm, with Loxp)     2ug, 200ng/ul
产品内容
组件 规格
Validated sgRNA plasmid 2ug, 200ng/ul
Blank vector 2ug, 200ng/ul
Cas9 vector 2ug, 200ng/ul
Donor (homozygous arm, with Loxp) 2ug, 200ng/ul

 

附件1. U6-sgRNA-mCherry图谱

U6-sgRNA-mCherry图谱

附件2. Cas9蛋白质粒

Cas9 vector

附件1和附件2的载体原件说明:
CMV启动子:是真核生物中使用最广泛的启动子之一,能够在哺乳动物细胞中高效表达。
Cas9蛋白:核酸内切酶,能够将DNA双链打断。
Amp抗性基因:在原核克隆过程中,可用于筛选阳性克隆株。
mCherry:荧光标记基因,转染后可用于观察转染效率。
U6启动子:有精确的转录起始位点和终止位点,能够准确的转录出sgRNA,主要适用于哺乳动物细胞。
sgRNA;识别DNA特定位点。
 

 

附件3. Donor序列

在Donor插入到基因组上之后,可通过Cre-Loxp的工作原理将Puro的筛选标记去除。
Left-Homologuos Arm-Loxp-Puro-Loxp-Right-Homologus Arm
 

donor片段

 

技术原理

CRISPR/Cas9 技术是一种存在与细菌或古细菌中,利用自身防御机制抵御外源病毒或DNA入侵自身的免疫系统。在该机制中,病毒DNA入侵细菌后,被记忆在细菌的基因组中。当该病毒DNA再次入侵时,存在于细菌中的记忆片段会与Cas9核酸酶结合成复合物,识别外源DNA并进行剪切,最终造成外源DNA双链断裂。

CRISPR/Cas9切割示意图


在传统的CRISPR/Cas9系统中,是有crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白3个原件组成并完成DNA的识别与剪切。而在后期优化后,将crRNA和tracrRNA链接在一起,构成了大家常说的guideRNA。在不降低识别效率和切割效率的基础上,增加了实验的简便性。

Cas9-single RNA

同源修复:通常是按照特定的要求进行精准的修复机制,但同源修复的比例很低,这也是精准基因编辑的难点。

非同源末端连接:该修复机制在细胞中占很大比例,通常会出现插入或删除数个碱基的方式进行。这种修复模式随机性很大,所以是用于敲除基因的有力手段。
 

 

技术流程

CRISPR/Cas9 基因敲除细胞技术流程图:

常见问题

出现的问题

解决方案

提取质粒浓度过低 在摇菌过程中要注意观察菌液的浓度,菌液老化或浓度过低均会出现质粒提取浓度较低的现象。
转染效率低 1. 对于不同的细胞,转染条件需进行优化,可固定一个值,对另一个值进行梯度的浓度稀释,以获得最佳的转染条件
2. 可调整细胞转染体系中各质粒与Donor的比例。
 
引物不工作

在PCR实验中需加入野生型样品作为阳性对照,如阳性对照出现正确的条带,说明引物可用,需重新收集敲除样品;如阳性对照未出现正确条带,需重新设计引物。

测序结果不正确 切胶过程中选择的位置不准确。
1. 如在野生型的位置出现相应的条带,可对切胶的产物进行TA克隆并测序鉴定。
2. 如在非野生型的位置出现条带,也可以进行切胶检测,此片段多为大片段插入。
 
PCR产物测序结果为套峰 由于基因在染色体上存在两个或两个以上等位基因,同时还有拷贝数的存在。因此PCR产物直接测序会出现套峰的结果。
可通过拆峰软件分析各种编辑的情况。再通过切胶回收PCR产物,通过TA克隆来验证。
 

 

产品目录

以下列表中的基因均已配备相应CRISPR Knockout 试剂盒,并已经过验证,同时有相应的基因敲除细胞系产品。

AKT1 CTSB IRS4 MRAS PTEN
AKT2 DAPK3 ITPR1 MTMR4 RAF1
ATG12 DDIT4 KRAS MTOR RPS6KB1
ATG14 EIF2AK3 LAMP2 NRAS RPS6KB2
ATG16L1 ERN1 MAP2K1 NRBF2 RRAS
ATG2B GABARAP MAP2K2 PIK3R1 RRAS2
ATG3 GABARAPL2 MAP3K7 PIK3R2 STK11
ATG4D HIF1A MAPK1 PIK3R3 TP53INP2
BAD HMGB1 MAPK9 PRKACA VAMP8
CAMKK2 IGF1R MLST8 PRKACB WIPI1