IncRNA

蛋白编码基因仅占3%不到的基因组,研究者发现越来越多的非编码元件在生命活动中发挥极其重要的作用,比如非编码RNA、特别是长非编码RNA(LncRNA)的异常与癌症等很多疾病的发生发展相关。

对编码蛋白基因的敲除可以通过基因组编辑技术对目标区域实行单点切割、引入小片段插入或缺失(indels)以造成基因翻译读码框破坏,然而这一方法对于不依赖读码框的非编码元件作用有限。

博雅辑因公司为此建立了paired-guide RNA (pgRNA) 文库的构建方法,通过pgRNA引入的基因组大片段删除来破坏LncRNA表达及功能,并由慢病毒介导在多个癌细胞系中实现了功能筛选。

工作流程

博雅辑因使用双sgRNA(pgRNAs)的筛选策略,我们根据客户的需求设计LncRNA大片段删除的sgRNA文库。整个筛选由使用包含pgRNA文库的慢病毒侵染细胞开始,在合理控制侵染复数(multiplicity of infection,MOI)的基础上,每个被侵染的细胞,仅有单一的pgRNA被整合进细胞的基因组。在侵染完成后,使用流式进行分选或其他富集方式,通过对细胞表型的观察对细胞进行聚类,后续则利用深度测序观察不同类别细胞群内pgRNA丰度的变化,来判断哪些LncRNA参与在我们研究的生物问题中。
 

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CRISPR高通量LncRNA筛选适用于

  • 研究影响细胞增殖的非编码元件;
  • 筛选发挥其他重要作用的非编码元件;
  • 研究基因组中的功能未注释区域;
  • 寻找癌症的药物靶点;
  • 发现潜在联合治疗的靶点或信号通路;

案例展示:lncRNA筛选鉴定出正向及负向调控癌细胞增殖的lncRNA

 

目的:通过构建12,000 pgRNAs 的CRISPR文库,从中鉴定出正向及负向调控癌细胞增殖的lncRNA。再通过多种遗传学手段验证候选lncRNA的功能,并使用生物信息分析和表达谱测序探究了其发挥作用的机制。


方法:

  • 使用博雅辑因独特的构建方法建立规模可控的pgRNA文库 ;
  • 利用pgRNA文库文库构建Huh7.5细胞文库;
  • 通过生长速率的不同来筛选出不同的细胞;
  • NGS测序barcode位点来鉴别关进lncRNA;
  • 后续实验进一步验证关键LncRNA的作用。

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图2 正向和负向筛选获得的候选LncRNA

   

CRISPR高通量编码基因筛选


Reference

Zhu S, Li W, Liu J, Chen C-H, Liao Q, Xu P, Xu H, Xiao T,Cao Z, Peng J, Yuan P, Brown M, Liu X* & Wei W*. (2016) CRISPR/Cas9-mediated genomic deletion screening for long non-coding RNAs using paired-gRNAs. Nat Biotechnol, 34(12):1279..