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文库说明

一、产品组成

 Edi-HTS™ KPP慢病毒颗粒

病毒滴度:2Xl08TU/ml;规格:200 µL/管;数量:12管。

二、产品说明

人类Kinase & Phosphotase & Plasma membrane病毒文库Edi-HTSTM KPP是sgRNA载体文库,其中每个编辑基因均有6-10个靶点sgRNA,可以在人类细胞内敲除所有的Kinase & Phosphotase & Plasma membrane相关编码基因,结合药物筛选及二代测序可以快速得到相关的耐药或者增敏基因。EdiGene的Edi-HTSTM KPP病毒文库根据人类基因组Hg38版本作为基础,依据EdiGene自主开发的DeepRank算法进行设计,选择在人类基因组上没有脱靶位点的sgRNA作为目标基因的sgRNA,运用该算法设计的sgRNA敲除效率已经过上千个基因敲除细胞系的验证。运用该病毒文库进行细胞文库构建,可在Cas9稳定且高效表达的细胞系中进行Kinase & Phosphotase & Plasma membrane相关基因的敲除,从而保证高效的细胞文库敲除效率。该文库已进行大量扩增和包装,且经过NGS多次验证其完整性。

三、应用范围

1.    筛选细胞增殖相关基因
筛选细胞增殖相关基因是基因组文库的基础应用,Edi-HTSTM KPP病毒文库大规模感染靶向细胞后,关键基因被敲除的细胞增殖变慢或者死亡,而非关键基因敲除的细胞仍可正常分裂。随着细胞分裂,两种细胞的数目差异越来越大,通过高通量测序比较感染早期和感染后期sgRNA差异便可找到与细胞增殖相关的基因。
2.    药物靶点筛选:耐药基因和增敏基因
Edi-HTSTM KPP病毒文库大规模感染靶向细胞后,进行药物处理(ICMax),敲除了药物靶向基因的细胞由于解除了药物抑制,从而导致细胞分裂变快,而敲除了药物非靶向基因的细胞生长仍被抑制。随着细胞分裂,两种细胞的数目差异越来越大,通过高通量测序比较感染早期和感染后期sgRNA差异便可找到耐药基因。
Edi-HTSTM KPP病毒文库大规模感染靶向细胞后,进行药物处理(IC20),敲除了药物靶向基因的细胞由于增强了药物敏感性,从而导致细胞分裂变慢或死亡,而敲除了药物非靶向基因的细胞生长不受影响。随着细胞分裂,两种细胞的数目差异越来越大,通过高通量测序比较感染早期和感染后期sgRNA差异便可找到敏感基因。
3.    多靶点协同作用研究
通过Edi-HTSTM KPP病毒文库筛选得到细胞增殖相关基因或者药物靶向基因之后,可应用该信息进行两两组合,再次进行筛选,从而获得协同致死基因、蛋白互作基因或者通路基因。

文库质量检测
Parameters sgRNA Library
Sequencing Depth 100×
sgRNA Lost 0.03%
Gene Lost 0%
sgRNA distribution ( 90% : 10%) 7.31
Total sgRNA 33776
Total Gene 4255

 

 

文库慢病毒包装

一、实验流程

EdiGene采用失活型慢病毒包装系统完成病毒文库包装过程。病毒包装共需要三个质粒,分别为携带Edi-HTSTM KPP文库的质粒和两个病毒包装辅助质粒pHelper 1和pHelper 2。
Edi-HTSTM KPP采用三质粒共转染293T细胞。在转染完成后72 h收获病毒,并浓缩纯化得到高滴度的慢病毒保存液,测定病毒滴度。

二、Edi-HTSTM KPP文库病毒包装

1. 接种1X107个细胞于细胞培养瓶中,置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h后,细胞密度达~80%,可用于转染;
2. 转染前2 h更换为无血清培养基;
3. 向一无菌离心管中加入质粒转染混合试剂,其中包含Edi-HTSTM KPP文库质粒20 ug、 pHelper 1质粒20 ug以及pHelper 2质粒5 ug,该混合试剂在室温下静置15 min后,加入细胞培养瓶中,置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养;
4. 培养6 h后,弃去含有转染混合物的细胞培养基,用PBS缓冲液清洗后,更换为新鲜配制的全培养基,置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养72 h后,收集细胞上清液,获得Edi-HTSTM KPP文库病毒;

三、Edi-HTSTM KPP文库病毒浓缩与纯化

1. 将细胞上清液于1000 rpm、4℃离心10 min,除去细胞碎片;
2.    用0.45 um滤器过滤上清液于浓缩超滤管中,于4000 g、4℃离心30 min,进行病毒浓缩;
3. 将浓缩后的病毒按规格进行分装,并且检测病毒滴度;

四、慢病毒滴度检测

1. 接种1X104个细胞于96孔板中,置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养;
2. 细胞接种24 h后,按照梯度稀释的方法将病毒加入细胞孔中,置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养;
3. 病毒侵染24 h后,更换新鲜配制的完全培养基,置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养;
4. 病毒侵染72 h后,加入1 ug/ml Puromycin进行抗性筛选;
5. 抗性筛选48 h后,未经病毒侵染的细胞(Negative Control)全部死亡,检测细胞活率。
6. 采用细胞侵染效率为10%-20%的病毒加入量计算病毒滴度。

五、慢病毒滴度检测结果

 经检测,Edi-HTSTM KPP病毒滴度检测结果为2X108 TU/ml(表2)。
表2. Edi-HTSTM KPP病毒滴度检测

病毒量(ul) 病毒侵染效率(%)
0.02 2.98
0.04 10.65
0.08 21.83
0.16 36.17
0.31 62.25

 

文库使用

一、实验流程

高通量遗传筛选流程包括以下步骤:病毒文库侵染靶向细胞;细胞文库抗性筛选;细胞文库药物筛选;筛选后富集细胞基因组DNA提取;富集sgRNA二代测序;测序结果分析(图5)。
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二、实验步骤

1. Puromycin细胞毒性测定
1.1 接种适量细胞于96孔板中,置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养;
1.2 细胞接种24 h后,按照梯度稀释的方法将Puromycin加入细胞孔中,置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养;
1.3 加入Puromycin处理48 h后,检测细胞活率,选用可杀死目的细胞的最低浓度作为细胞文库抗性筛选所使用的Puromycin浓度。
2. 文库病毒对目的细胞滴度检测
2.1 接种适量目的细胞于96孔板中,置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养;
2.2 目的细胞接种24 h后,按照梯度稀释的方法将病毒加入细胞孔中,置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养;
2.3 病毒侵染24 h后,更换新鲜配制的完全培养基,置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养;
2.4 病毒侵染72 h后,加入预先摸索的Puromycin浓度进行抗性筛选;
2.5 抗性筛选48 h后,未经病毒侵染的细胞(Negative Control)全部死亡,检测细胞活率。
2.6 采用细胞侵染效率为10%-20%的病毒加入量计算病毒滴度。
3. 细胞文库构建
3.1在细胞培养皿中铺适量Cas9稳定表达的目的细胞,细胞数根据文库大小、覆盖倍数、MOI以及生物学重复的个数决定,另设空白对照组。
In Total Cell Number for Transduction=(Number of sgRNA×1000)/(30%)×N Replicates
3.2 弃去细胞液,更换成含有相应体积的病毒进行侵染。另设空白对照组,不加病毒。
Volume of Virus for Each Dish=(Cell Number of transduction in each dish×MOI)/(Titer of Virus) (MOI=0.3)
3.3病毒侵染24h之后,弃去原细胞培养基,更换成新鲜的细胞培养基。空白对照组进行同样的操作。
3.4 上述细胞换液培养72h后,更换成含有预先摸索好的Puromycin浓度的细胞培养基进行筛选。待空白对照组的细胞全部死亡之后(约48h),收集所有细胞,即为细胞文库。将该细胞文库稳定传代1-2周之后,将其分为3份:一份用于冻存,一份用于Control,一份用于药物筛选。
4. 药物筛选
4.1 将上述筛选得到的细胞文库按照一定的细胞浓度接种于细胞培养皿中,分别分为Control组和实验组,每组设置N个Replicates。
4.2 细胞接种24h后,在实验组中加入预先摸索好的筛选用药物浓度;
4.3 药物筛选72h后,分别收集各组细胞,提取基因组,进行PCR后,将PCR产物用于测序。